牙本質是一種獨特的，無血管的礦化結締組織，形成了牙齒的大部分。它包圍在牙髓組織外面。牙本質由成牙本質細胞分泌，其構造分基質和牙本質小管-纖維兩部分。在光學顯微鏡下可見到牙本質內有許多緊密排列的小管，小管與小管間是基質。
牙本質基質中主要的細胞外基質蛋白是一種富含天冬氨酸和絲氨酸的蛋白質，稱為牙本質磷酸化蛋白（DPP）。用 DPP 處理的祖幹細胞會刺激細胞內鈣的釋放，鈣的消耗會引發許多下游反應。
DPP 可啟用 DPSCs（牙髓幹細胞）中的 Wnt 訊號通路。先前的研究表明，Wnt 訊號通路是牙齒形成所必需的。瞭解介導成體幹細胞分化以再生牙本質-牙髓複合體的分子機制對再生牙科醫學至關重要。這個過程需要細胞增殖和分化之間的微妙平衡。
在牙齒髮育過程中，Wnt5a mRNA 在發育中的成牙本質細胞中廣泛表達，Wnt5a 缺陷小鼠的成牙本質細胞分化延遲，牙齒較小且形狀異常。哺乳動物基因組編碼 19 種 Wnt 蛋白和幾種受體，這些成分相互作用的方式表明在牙齒髮育過程中上皮和間充質細胞中存在動態且嚴格控制的表達模式。然而，關於 Wnt5a 在牙齒間充質中啟用的機制的資訊很少。
基於此，來自伊利諾伊大學芝加哥分校的研究人員揭示了細胞外基質蛋白 DPP 透過誘導 Wnt5a 介導的訊號通路，促進成體幹細胞分化為牙源性譜系的分子機制。相關成果以“DPP an extracellular matrix molecule induces Wnt5a mediated signaling to promote the differentiation of adult stem cells into odontogenic lineage”為題發表在 Scientific Reports 上。華人學 者 Yinghua Chen 為本文一作。
研究人員首先發現 DPP 和 Wnt5a 由 DPSCs 作為外泌體分泌，且 DPP 刺激了 Wnt5a 的分泌。免疫染色結果顯示：Wnt5a 和 DPP 存在於 DPSCs 的細胞外基質中。
隨後，為了證明 DPP 刺激可誘導 Wnt5a 的表達，對不同 DPP 濃度培養基中培養的細胞總蛋白進行 Western Blot 檢測，結果顯示：Wnt5a 蛋白的表達隨著 DPP 的刺激而持續增加，並且其表達水平一直維持到 72 h。為了證明 DPP 介導的 Wnt5a 的分泌，研究人員對 DPP 和抑制劑 TPCA-1 刺激的 DPSCs 的分泌組進行實驗測試。實驗結果均證實了 DPP 刺激了 Wnt5a 的分泌，而該活性透過阻斷 TPCA-1 的 NF-ĸB 訊號通路而被抑制。
圖 | DPP 和 Wnt5a 由 DPSCs 作為外泌體分泌，刺激 DPSCs 啟用 Wnt5a 訊號
研究人員接下來證明了 DPP 刺激誘導 Wnt5a 依賴的穩定性，分析 DPP 介導的 Wnt5a 啟用是否可以協調β-連環蛋白向細胞核的易位。用 DPP 對細胞進行不同時長處理發現，在 DPP 刺激 5min 時，β-Catenin 的核定位就開始積累。而透過 Wnt5a 拮抗劑 Box5 預處理破壞 Wnt5a 與其受體之間的相互作用，DPP 刺激下β-連環蛋白的核易位水平降低。這些研究證實了 DPP 介導的 Wnt5a 啟用促進了β-連環蛋白的核易位，並且在沒有 Wnt5a 的情況下，它們的易位可能會被終止。
圖 | DPP 刺激 DPSCs 透過啟用 WNT5A 促進β-連環蛋白的核易位
此前，研究人員已經證明了 DPP 刺激可以上調關鍵的牙源性基因如 RUNX2、OSX、ALP 和 OCN29 的表達。為了進一步分析作用機制，研究人員增加這些轉錄本，觀察其是否受到 Wnt/β- 連環蛋白訊號通路的調控。結果顯示，在沒有抑制劑的情況下，DPP 處理的 DPSCs 有效地顯示了 RUNX2、OSX、ALP、氰酸鹽和 DMP1 的表達增加。相反，用 Wnt/β- 連環蛋白通路抑制劑和 DPP 刺激預處理 DPSCs，導致基因表達降低。
圖 | DPP 透過 Wnt5a/β- 連環蛋白訊號通路啟用牙源性標記物的表達
隨後，研究人員透過一系列實驗證明了 DPP 啟用 Wnt5a/β- 連環蛋白訊號通路的分子機制。特異性 Wnt 受體的可用性是決定 Wnt 訊號下游靶點的特異性和表達強度的關鍵因素。DPP 刺激透過典型和非典型訊號通路促進 Wnt5a 與受體訊號通路的共定位，促進 Wnt5a 在細胞膜上與 Ror2 受體的結合並隨後的內化。以上實驗結果均驗證了 DPP 可以啟用下游的訊號事件，導致成牙本質細胞極化。
圖 | DPP 刺激啟用 Wnt5a 訊號通路的受體和共受體
為了研究 DPP 介導的牙源性分化是否需要 Wnt5a，研究人員使用 CRISPR 構建了一個 DPSC/Wnt5a KO 細胞系。為了評價 DPSC 和 DPSC/Wnt5a 的牙源性分化潛能，將 KO 細胞在有/無 DPP 的分化條件下培養 3 周。收集細胞，透過 Real-time PCR 檢測關鍵牙源性標記物的表達。結果顯示：促牙源性轉錄因子 RUNX2 和 OSX 在分化、刺激過程中表達增加，DPP 的加入會增加這種表達，而在 Wnt5a KO 的基因缺陷細胞中，牙源性標記物的表達水平降低。
圖 | DPP 介導的 Wnt/βcatenin 訊號通路對 DSPP 向成牙細胞系終末分化的影響
此外，研究人員證實了在 DSPP 缺失的轉基因小鼠中 Wnt5a 訊號通路受損。Wnt5a 及其訊號成分的定位模式證實了在 DPP 缺失的情況下， Wnt 訊號通路受損。與細胞水平的實驗結果一致。
圖 | Wnt5a 和 Wnt5a 訊號成分在 WT 和 DSPP-KO 小鼠中的表達
綜上所述，在牙髓中發現的成體幹細胞是牙本質修復和再生的重要細胞來源。在 DPSC 的牙源性分化過程中，有幾個訊號事件被啟用。研究人員證明了基質中的 DPP 可以啟用 Wnt5a 介導的訊號通路，促進其向成牙本質細胞分化。因此，DPP 介導的 Wnt5a 訊號通路可能是受損牙本質礦化修復和再生的治療靶點，為成牙再生提供了新的視角和理論支援。
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