撰文 | 阿童木
溶酶體的主要功能之一是透過酸性水解酶降解來源於脂蛋白、脂滴或細胞膜等的脂質，一般認為，這種降解主要發生在溶酶體腔內，因為溶酶體膜能夠透過糖鏈保護膜免受酸性水解酶的侵蝕。膜脂質的降解需要形成腔內小泡 （ILVs） ，以使酸性水解酶能夠接觸到膜脂質。ILV的膜與其他細胞膜在成分上有所不同，富含一種特定的磷脂——雙（單醯基甘油磷酸）脂（BMP），其在ILV中的磷脂含量可達70%【1】。在溶酶體的pH（4.5-5.0）條件下，BMP帶負電荷，能夠與某些酸性水解酶的正電區域結合。BMP介導的脂質降解對於細胞至關重要，缺乏BMP會導致神經節苷脂降解受阻，而神經節苷脂的過度積累對神經系統具有毒性【2】。此外，BMP介導的溶酶體脂質降解的動態變化被認為是神經發育和神經退行性疾病的重要標誌。
為了維持ILV中的BMP水平，BMP必須避免被溶酶體磷脂酶降解。那麼，這種脂質是如何抵抗溶酶體的降解的呢？這與溶酶體BMP的特殊立體化學構型有關。BMP含有兩個甘油分子，而溶酶體BMP的兩個甘油手性碳都是S構型，而不是常見於甘油磷脂中的R構型，S,S-構型被認為能夠潛在保護BMP免受溶酶體酸性磷脂酶的降解【3】。
此外，理解BMP合成的關鍵問題在於探明細胞是如何催化形成這種特殊的S,S-構型的。一般認為，BMP是透過多步驟的途徑由前體R,S-磷脂醯甘油 （PG） 合成的。由於前體脂質PG是BMP的異構體，其合成途徑可分為兩個主要步驟：甘油磷酸甘油骨架周圍醯基的重排，以及R構型甘油向S構型甘油的立體轉換，從而生成具有雙S構型的BMP，這也是哺乳動物溶酶體中存在的BMP形式。
近日，紀念斯隆凱特琳癌症研究所Tobias C. Walther實驗室和Robert V. Farese, Jr.實驗室等合作在Cell雜誌發表了題為PLD3 and PLD4 synthesize S,S-BMP,a key phospholipid enabling lipid degradation in lysosomes的研究文章。研究發現，溶酶體中磷脂酶PLD3和PLD4酶透過催化甘油的立體轉化反應來合成S,S-BMP，缺乏這些酶會導致大腦中BMP水平下降，誘發以神經醯胺為代表的脂質積累以及溶酶體功能異常。這些異常會進一步誘發神經病理紊亂，並與等疾病的風險增加相關。本研究揭示了PLD3/4透過調控BMP水平，在維持脂質代謝和神經穩態過程中發揮了關鍵作用。
先前的研究表明，BMP可能由PG （磷脂醯甘油） 合成，本研究在人體HMC3小膠質細胞和HEK293T細胞中測試了這一假設，發現BMP是由PG水解產生的溶-PG （lyso-PG） 進一步合成的。細胞中的18:1/18:1 PG和溶-PG （而非其他甘油磷脂） 的增加導致了BMP水平的顯著提升，這證明了溶-PG是BMP合成的前體物質。
BMP合成的一個關鍵方面是生成在溶酶體中穩定的S,S-BMP。作者驗證了S,S-BMP是否如假設那樣，比其他立體異構體在純化的溶酶體中更為穩定。透過將R,R-、R,S-或S,S-立體異構體的18:1/18:1 BMP與HMC3細胞的溶酶體提取物共同孵育，作者發現S,S-BMP比其他立體異構體在溶酶體中更具抗降解性。進一步實驗發現S,S-BMP的合成涉及溶-PG和MAG透過轉磷脂化反應生成，這一過程導致甘油部分的立體反轉，這種反轉在酸性條件下更為明顯，是合成穩定S,S-BMP所必需的步驟。
接下來，作者鑑定了能夠催化轉磷脂化反應以產生S,S-BMP的酶。已有研究表明，磷脂酶D（PLD） 類酶能夠催化此類反應。相較於其他PLD，作者發現過表達PLD3或PLD4能夠顯著增加BMP的合成活性，而關鍵催化位點的突變會消除這一活性。此外，特定PLD3突變與神經退行性疾病 （如脊髓小腦共濟失調症和阿爾茨海默病） 的發生有關，這些突變不僅影響了溶酶體定位，還削弱了BMP合成功能。探究PLD3或PLD4催化BMP合成的機制後，作者發現PLD3和PLD4酶在體外能夠透過轉磷脂化反應從lyso-PG和MAG底物合成S,S-BMP。透過手性衍生化和水解實驗進一步驗證了PLD3和PLD4所合成的BMP為S,S-立體構型，這種構型使其對溶酶體的降解具有更強的抵抗力。
隨後，為了驗證PLD3和PLD4在細胞內是否參與BMP合成，作者使用CRISPR-Cas9基因編輯技術生成了PLD3敲除的HMC3和HEK293T細胞。透過敲除PLD3，研究發現BMP水平顯著降低，進而引發溶酶體功能障礙，如神經節苷脂的積累、內含體小泡 （ILV） 減少以及溶酶體膜受損。此外，BMP的缺乏與溶酶體膽固醇水平升高有關，而補充S,S-BMP可以恢復這些異常。PLD3也與核酸降解功能相關，但BMP的合成受影響主要還是由於脂質代謝變化引起的。因此，PLD3和PLD4是細胞內合成BMP的關鍵酶，尤其是PLD3在HMC3和HEK293T細胞中作用更為重要。
此外，PLD3和PLD4的功能在體內具有冗餘性，但在不同組織中，它們的表達和功能各有側重。PLD3在中樞神經系統中高度表達，敲除PLD3會導致小鼠大腦中BMP水平顯著降低，並伴隨神經節苷脂的積累。而PLD4則在脾臟和髓樣細胞中表達較高，敲除PLD4會導致脾臟中的BMP水平大幅下降，並引起神經節苷脂的積累及脾臟腫大。這些結果揭示了PLD3和PLD4在不同組織中的特異功能，及其對BMP代謝和神經節苷脂降解的調控作用。
綜上所述，本研究探討了磷脂酶D3 (PLD3) 和磷脂酶D4 (PLD4) 在生理條件下催化lyso-PG和MAG 轉化為雙磷脂酸 (BMP) 的機制，揭示了它們在溶酶體BMP合成及脂質代謝中的作用，並透過小鼠模型展示了它們在神經系統和免疫系統中的獨特功能。這些發現有助於理解PLD3和PLD4異常所導致的相關疾病的發病機制，併為未來開發治療策略提供了理論基礎。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.036
製版人：十一
參考文獻
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2. Schulze, H., and Sandhoff, K. (2014). Sphingolipids and lysosomal pathologies.Biochim. Biophys. Acta1841, 799–810.
3. Gruenberg, J. (2020). Life in the lumen: The multivesicular endosome.Traffic21, 76–93.
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