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NGS在真實世界中的普及性有待進一步提高，有望讓更多患者從新型靶向藥物中獲益，從而推動精準診療的發展。
乳腺癌作為女性相關死亡的主要原因之一，目前已有多種藥物靶向性生物標誌物和預測性生物標誌物被開發出來。下一代測序（NGS）技術在乳腺癌的精準診療領域扮演著至關重要的角色，並已成為針對TP53、PIK3CA、ESR1、BRCA1/2等常見突變基因檢測的首選技術。近期，一項研究[1]對NGS在乳腺癌真實診療環境中的應用進行了評估，研究結果顯示NGS能夠提供關於乳腺癌預測性生物標誌物和藥物靶向性生物標誌物的重要資訊。這些發現不僅推動了精準診療的進步，還為患者參與新藥臨床試驗提供了更多可能性。展望未來，進一步的研究有望揭示新的藥物靶向性生物標誌物，並促進更多新型靶向治療方案的開發。
“醫學界”特邀北京大學醫院姜晗昉教授詳細解讀該研究，現攫取重要內容整理如下，以饗讀者。
試驗方法
●患者選擇
研究者對2010年至2021年期間在三星醫療中心接受乳腺癌治療的患者進行了回顧性分析，共納入180例患者，這些患者在活檢或手術過程中採集的組織樣本被用於進行下一代測序（NGS）。研究者詳細分析了這些患者的組織病理學特徵和基因特徵。透過計算機斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）以及正電子發射斷層掃描（PET-CT）的影像學資料，依據美國癌症聯合委員會第8版標準，研究者針對每位患者的初始臨床分期和病理分期進行了精確判定。
●組織病理學分析和免疫組化
本研究使用福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)組織進行組織病理學分析和免疫組織化學(IHC)染色。所有FFPE組織均使用蘇木精和伊紅染色。由3名乳腺病理學家（H.L.、Y.A.C.和E.Y.C.）審查詳細的組織病理學特徵。使用LeicaBOND-III系統(LeicaBiosystems,Wetzlar,Germany)對FFPE組織的4μm切片進行IHC染色，以染色雌激素受體(ER；6F11，1:300，Novocastra，NewcastleuponTyne，UK)、孕激素受體（克隆16，1:1,200，Novocastra）、p53(DO7，1:1,200，LeicaBiosystems)、Ki-67(MIB1，1:200，Dako，Carpinteria，CA)、細胞角蛋白5/6(D5/16B4，1:100，Dako)和VentanaBanchMarkXT平臺(VentanaMedicalSystemsInc.，Tucson，AZ)，根據生產商方案進行HER2染色(4B5，VentanaMedicalSystemsInc.)。
使用QIAamp DSP DNA FFPE組織試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)從5μm FFPE切片中提取腫瘤DNA，並使用QUBIT dsDNA BR檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)對提取的DNA進行定量。對於靶標捕獲，研究者根據生產商的方案使用了SureSelectXT自動化試劑盒(Agilent,SantaClara,CA)。使用條形碼製備配對末端測序文庫。為了驗證基因組DNA的大小和質量，研究者使用了基因組DNA分析ScreenTape和基因組DNA試劑與Agilent4200磁帶站(Agilent)。使用TG Next Seq500/550高輸出試劑盒v2(Illumina,Inc.,SanDiego,CA)和TGNextSeq500/550中輸出試劑盒v2(Illumina,Inc.)對文庫進行測序。
自2018年3月起至2020年10月，本研究透過應用定製化的NGS面板CancerSCAN，對70例病例進行了分析。該面板針對與實體瘤相關的375個基因進行了靶向測序。使用基於雜交捕獲的TruSight Oncology（TSO）500DNA/RNA NextSeq試劑盒（Illumina,Inc.）分析2020年11月至2022年7月為NGS研究收集的其他110例病例。CancerSCAN和TSO500均由同一技術人員進行，結果由同一病理學家（H.L.和E.Y.C.）分析。TMB定義為每兆鹼基(Mb)的體細胞突變數。TMB＜10定義為低TMB，TMB≥10定義為高TMB。為了準確計算TMB，排除了所有同義SNV、Indels、CNAs和融合變體。在用TSO500檢測的病例中，根據生產商的說明，使用130個均聚物微衛星位點評價微衛星不穩定性（MSI）狀態。當不穩定部位的百分比≥20%時，將病例歸類為高度微衛星不穩定（MSIH）。
研究結果
●患者臨床病理學特徵
僅4例(2.2%)患者為男性，其餘176例為女性。患者平均年齡為41.46歲，絕經前117例(65.0%)。34例患者在輔助化療後出現區域性復發或遠處轉移，136例患者在新輔助化療(NAC)或姑息治療期間出現疾病進展。其餘10例患者中9例行NAC並顯示部分緩解，1例未接受NAC。這10例患者在隨訪期間均未顯示任何復發或遠處轉移的證據。平均隨訪期為64.02個月（6.20-289.87個月）。隨訪期間，77例患者死於該疾病，81例患者診斷為乳腺癌。僅22例患者無疾病證據。最常見的組織學診斷為無特殊型別的浸潤性乳腺癌(159/180，88.3%)，其次為化生性癌(14/180，7.8%)和浸潤性小葉癌(4/180，2.2%)。根據IHC結果將病例進行分層後，三陰性乳腺癌（TNBC）為96例(53.3%)，HR+/HER2-乳腺癌為72例(40.0%)。在本研究人群中，62例患者(34.4%)在姑息性化療期間接受NGS，58例在NAC後，34例在手術和輔助化療後，26例在診斷時接受NGS。
在研究樣本中，95例(52.8%)來自手術(66，69.5%)或活檢(29，30.5%)期間的原發性乳腺癌。另外85例樣本(47.2%)取自轉移性乳腺癌。從轉移性乳腺癌獲得的病例樣本中，60例(70.6%)透過活檢獲得，25例(29.4%)在手術期間獲得。最常見的轉移部位是肝臟(27/85，31.8%)，其次是淋巴結(14/85，16.5%)、肺(12/85，14.1%)、胸膜(12/85，14.1%)和腦(6/85，7.1%)。
●分子改變
最常檢測到的SNV是TP53突變(123/180，68.3%)，其次是PIK3CA突變(51/180，28.3%)。CNAs中MYC擴增(36/180，20.0%)發生率最高，其次為CCND1擴增(22/180，12.2%)（圖1）。HR+/HER2-乳腺癌和TNBC中分子改變的詳細患病率總結見表1和表2。將本研究中分子改變的發生率與來自癌症基因組圖譜(TCGA)和乳腺癌國際聯盟分子分類學(METABRIC)的結果進行比較，透過cBioPortal訪問。在HR+/HER2-乳腺癌中，ESR1的SNV頻率在統計學上高於TCGA，TP53的SNV頻率在統計學上高於TCGA和METABRIC（Benjamini-Hochberg校正p值<0.05）。HR+/HER2-乳腺癌的CNAs頻率及TNBC的SNVs和CNAs頻率差異無統計學意義。
圖1. 臨床病理學特徵和基因改變的示意圖
表1. 文獻報道的乳腺癌中不同基因SNV、插入和缺失的發生率
表2. 文獻報道的乳腺癌中不同基因擴增的頻率
●PIK3CA突變
本研究中28.3%(51/180)的患者檢測到PIK3CA SNV，在1例患者中檢測到PIK3CA擴增。關於PIK3CA SNV的詳細資訊總結見表3。最常見的PIK3CA突變為H1047R(43.1%，22/51)，其次為E545K(17.6%，9/51)、N345K(13.7%，7/51)和E542K(9.8%，5/51)。1例患者發現其他突變。在HR+/HER2-乳腺癌患者中，31/72例(43.1%)存在PIK3CA突變，11/96例(11.5%)TNBC患者存在PIK3CA突變。9例HER2陽性乳腺癌患者(9/12，75%)存在PIK3CA突變。HR+/HER2-乳腺癌、HER2陽性乳腺癌和TNBC中PIK3CA突變的詳細分佈如圖2所示。在therascreen檢測面板中，PIK3CA突變的比例為72.5%。在未包含在therascreen檢測面板的PIK3CA突變中，N345K是檢測到的頻率最高的突變（50.0%）（圖3）。根據IHC亞型校正後，預計34.7%(25/72)的HR+/HER2-乳腺癌患者可從磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路抑制劑中獲益。
表3. PIK3CA突變的詳細資訊
圖2. 基於免疫組化亞型的PIK3CA單核苷酸變異(SNVs)的分佈。(A)HR+/HER2-乳腺癌。(B)HER2陽性乳腺癌。(C)三陰性乳腺癌。所有亞型中最常見的SNV是H1047R
圖3. 基於therascreen檢測面板的PIK3CA單核苷酸變異(SNVs)的分佈。(A)therascreen檢測面板中PIK3CA SNV的流行率。(B)未納入therascreen檢測面板的PIK3CA SNV的分佈
●BRCA1/2突變
6例(3.3%)患者發現BRCA1突變，13例(7.2%)發現BRCA2突變。為確認胚系突變，從84例患者中採集匹配的正常血樣，並進行BRCA1/BRCA2測序。在這84例患者中，4例患者發現BRCA1胚系突變，5例患者發現BRCA2種系突變，NGS也檢測到所有突變。4例僅透過NGS檢測到BRCA2突變的患者被證實存在體細胞突變。在NGS檢測中，發現BRCA1基因突變的6例患者中，有2例未進行使用匹配血樣的BRCA1/BRCA2基因測序；同樣，在檢測出BRCA2基因突變的13例患者中，有4例未接受相應的測序檢測。
●ESR1突變
11例患者(6.1%)檢測到ESR1突變，其中10例(5.5%)為HR+/HER2-乳腺癌，另1例為TNBC。ESR1突變患者的詳細資訊總結見表4。2例HR+/HER2-乳腺癌患者和1例TNBC患者既往未接受過內分泌治療。1例患者有2個ESR1突變——E380Q/Y537D。ESR1突變詳情如下：8例SNV，5例D538G，1例E380Q/Y537D，1例L536H，1例L536_Y537insH，3例融合，2例ESR1:CCDC170融合，1例ESR1:TAB2融合。
表4. ESR1改變的乳腺癌患者的臨床特徵
●基於NGS結果的精準診療根據NGS分析結果，13例患者(13/180，7.2%)接受了靶向治療。該資訊詳見表5。4例患者攜帶BRCA1或BRCA2胚系突變，並接受PARP抑制劑治療。在BRCA突變患者中，3例患者在臨床試驗中接受了治療，另1例患者透過緊急試驗新藥擴大使用(e-IND)接受了靶向治療。另外9例患者存在PIK3CA突變，並接受PI3K通路抑制劑治療。在9例PIK3CA突變的患者中，6例患者可以透過e-IND獲得PI3K通路抑制劑治療，另外3例患者需要額外的分子診斷分析。
表5. 以精準醫學為基礎的靶向治療
●腫瘤突變負荷
平均TMB為7.37/Mb(0-68.7)，中位TMB為6.3/Mb。根據年齡（≤50歲vs.>50歲，7.03/Mb vs.8.29/Mb，p=0.426）、絕經狀態（絕經前vs.絕經後，6.93/Mb vs.8.29/Mb，p=0.329）、樣本是否來自轉移灶（原發灶vs.轉移灶，8.02/Mb vs.6.64/Mb，p=0.168），樣本是否在治療後獲得（初始vs.治療後，6.74/Mb vs.7.48/Mb，p=0.506）、NGS時間（初始vs.NAC後vs.復發時vs.姑息性化療期間，6.74/Mb vs.7.05/Mb，vs.6.38/Mb vs.8.48/Mb，p=0.448）或亞型（HR+/HER2- vs.HER2陽性vs.TNBC，7.73/Mb vs.9.98/Mb vs.6.78/Mb，p=0.270）分層，其TMB之間無顯著差異。11例患者為高TMB(6.1%)，高TMB病例的平均TMB為26.54（範圍，10.90-68.70；中位數，22.00）。在使用TSO500檢測的患者中，沒有發現具有高或低微衛星不穩定性的腫瘤型別，這可能影響該患者群體的預後和後續治療選擇。
研究結論
NGS在乳腺癌精準診療中的重要性毋庸置疑，但真實臨床環境中的普及性仍待進一步提高。不僅如此，鑑於NGS檢測能夠識別出預示侵襲性行為以及對內分泌治療或靶向治療耐藥的預測性生物標誌物，並且有助於發現可能使患者有機會參與臨床試驗的潛在藥物靶向性生物標誌物，從而對乳腺癌的預後進行預測。因此，NGS在晚期或轉移性乳腺癌患者中的潛在價值，值得透過進一步研究來深入探討。
專家介紹
姜晗昉 教授
北京大學腫瘤醫院乳腺腫瘤內科，腫瘤學博士、副主任醫師
北京大學腫瘤醫院臨床研究管理委員會委員
中國抗癌協會乳腺癌專業委員會委員
中國醫藥教育協會腫瘤臨床科研創新發展專業委員會常委
中國女醫師協會乳腺專業委員會常委
中國中醫藥研究促進會中西醫多學科腫瘤防治專業委員會常委
北京慢性病防治與健康教育研究會乳腺腫瘤專業委員會第一屆委員會常委
北京癌症防治學會乳腺癌精準靶向診療專業委員會委員
北京乳腺病防治學會健康管理專業委員會第二屆委員會委員
中國初級衛生保健基金會乳腺腫瘤專業委員會委員
美國加州大學舊金山分校醫學腫瘤中心訪問學者
參考文獻：
[1].Lee H, Cho YA, Kim DG, Cho EY. Next-Generation Sequencing in Breast Cancer Patients: Real-World Data for Precision Medicine. Cancer Res Treat. 2024 Jan;56(1):149-161.
審批編號：CN-145910 過期日期：2025-10-23
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