精子發生異常是男性不育的最主要致病因素，其中減數分裂是精子發生的一個獨特事件，是哺乳動物產生雄性配子的關鍵步驟，經歷減數分裂起始、同源重組修復、染色體分離、性染色體失活和減數分裂退出等過程。精子發生過程中的基因表達調控比較複雜，在減數分裂的起始階段 （meiotic entry） 和減數分裂的退出階段 （meiotic exit） ，存在兩個轉錄高峰，發生重要的基因表達重程式設計過程。儘管針對減數分裂起始的轉錄調控機制已取得多個重要進展，已鑑定STRA8是減數分裂起始的關鍵轉錄因子，在訊號分子視黃酸的誘導下，啟用減數分裂相關基因組，生精細胞分化進入減數分裂。但減數分裂退出階段的轉錄調控機制一直是領域的難題，關於生精細胞如何關閉減數分裂轉錄組，同時啟用單倍體圓形精子發育特異轉錄組仍不清楚。
2025年 1月 17日，南京醫科大學生殖醫學與子代健康全國重點實驗室葉嵐教授、顧亞雲教授，美國貝勒醫學院孫正教授和南京醫科大學神經生物學系林明焰教授等課題組合作，在Nature Communications線上發表了題為NKAPL facilitates transcription pause-release and bridges elongation to initiation during meiosis exit的研究論文，揭示了睪丸特異表達蛋白NKAPL調控減數分裂的功能。
該研究建立在減數分裂退出階段轉錄起始複合物SOX30/HDAC3的研究基礎上，與葉嵐課題組2018年在Development雜誌發表的 Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes和2021年Nucleic Acids Research雜誌發表的研究論文HDAC3 controls male fertility through enzyme-independent transcriptional regulation at the meiotic exit of spermatogenesis密切聯絡。前期的研究表明，SOX家族成員SOX30特異表達於生殖細胞中，在中晚期精母細胞和單倍體圓形精子高度富集，並含有進化上保守的DNA-binding結構域HMG-Box。染色質免疫沉澱測序 （ChIP-seq） 結果顯示，Sox30選擇性結合‘ACAAT’DNA序列，證明其是在晚期精母細胞和早期圓形精子細胞啟用單倍體基因的關鍵轉錄因子。SOX30敲除鼠的精子發生阻滯在早期圓形精子階段，在減數分裂退出階段與組蛋白去乙醯化酶HDAC3形成轉錄起始複合物，並以非去乙醯化酶依賴的方式促進基因的轉錄調控。儘管HDAC3對組蛋白進行去乙醯化修飾，通常抑制靶基因的表達，但在棕色脂肪、消化系統和生精細胞中，去乙醯化酶HDAC3結合組織特異性轉錄啟用因子，促進基因轉錄。
透過進一步免疫沉澱結合質譜技術分析和鑑定減數分裂退出階段轉錄起始複合物的蛋白質相互作用網路，猜測睪丸特異表達蛋白NKAPL與減數分裂退出階段的轉錄起始複合物SOX30/HDAC3存在關聯。Nkapl是X染色體上的Nkap基因逆轉錄到常染色體上的逆轉座基因，而Nkap在免疫系統中曾報道與HDAC3形成蛋白複合物抑制基因的轉錄。為了探索NKAPL在精子發生中的生物學功能，利用CRISPR/Cas9構建Nkapl基因敲除鼠，NKAPL缺失導致生精細胞在減數分裂退出階段出現發育異常，XII期生精管腔出現晚期精母細胞的凋亡，大部分生精管腔停滯在早期圓形精子階段，與Stra8-cre介導的睪丸特異性Hdac3或Sox30基因全敲導致減數分裂退出缺陷的現象類似。選取出生後21天齡野生型與Nkapl敲除鼠以及分選細胞的轉錄組分析結果顯示，與預期結果相反，NKAPL缺失引起大量單倍體精子細胞發育相關基因的下調，這與生精細胞中缺乏SOX30或HDAC3而導致的轉錄組變化相似。這些結果表明NKAPL、SOX30和HDAC3可能在同一訊號通路調控減數分裂退出階段單倍體基因的轉錄。
圖1.Nkapl KO小鼠睪丸中下調的基因與Sox30 KO和Hdac3 cKO睪丸中下調的基因具有相似性（引自原文Figure 2部分影象）
染色質免疫沉澱分析結果顯示，NKAPL主要結合靶基因的啟動子區域，結合位點位於轉錄起始複合物SOX30/HDAC3結合位點的下游。NKAPL敲除不影響SOX30 與HDAC3 之間的相互作用，但顯著增加SOX30/HDAC3複合物與靶DNA之間的親和力。這些結果提示，NKAPL缺失介導的單倍體精子細胞發育相關基因的下調可能與轉錄起始複合物SOX30/HDAC3在染色質發生停滯有關。高等動物RNA聚合酶II介導的轉錄是一個高度協調的過程，涉及轉錄起始、啟動子近端暫停、轉錄延伸、轉錄終止的動態轉變，如果轉錄起始一步出現阻滯，RNA Pol II的招募可能出現問題。然而，與預期結果相反，野生型和Nkapl敲除鼠的RNA Pol II ChIP-seq顯示，RNA Pol II 在單倍體發育基因啟動子區域富集水平上升。透過計算和比較野生型和Nkapl KO RNA Pol II 在啟動子近端的遷移比率，發現NKAPL缺失導致RNA Pol II在啟動子近端的遷移比率上升，提示RNA Pol II在靶基因近端啟動子的停頓增加。NKAPL ChIP-seq進一步提示NKAPL染色質結合訊號與啟動子近端Pol II峰型重疊。綜上結果，NKAPL特異調控RNA Pol II在啟動子近端的停頓釋放，是減數分裂退出階段的轉錄延伸因子。
轉錄早期，Pol II通常會暫停在轉錄起始點下游200 bp視窗內發生短暫停頓, 稱作啟動子近端暫停，是轉錄的關鍵調控步驟，與mRNA剪下加工過程密切相關。由於NKAPL蛋白含有精氨酸和絲氨酸 （arginine/serine-rich） 的RS結構域，具有潛在結合RNA的能力，可能透過招募新生RNA調控Pol II轉錄複合物的啟動子近端停頓。運用增強型共價交聯免疫沉澱 （eCLIP） 技術，獲得睪丸內源性NKAPL直接結合的靶RNA，經RNA純化和構建NKAPL-eCLIP測序文庫, 鑑定NKAPL靶向結合RNA主要為新生RNA，富集於啟動子下游40 bp，並特異性識別和結合含GAA串聯序列的RNA。文獻報道GAA串聯序列富集於植物擬南芥轉錄過程中形成的R-loop結構，生信分析提示GAA串聯序列在哺乳動物R-loop富集，提示R-loops生成優先發生在高等真核生物基因組的保守基因熱點。
R-loop是轉錄產生的大量新生RNA鏈與開啟的雙鏈DNA其中一條鏈發生鹼基互補配對，形成RNA-DNA雜合鏈，同時與未配對的另一條DNA鏈遊離在外組成的三方結構。進一步運用DNA:RNA雜合鏈免疫共沉澱高通量測序技術（ssDRIP-seq）捕獲生精細胞中的R-loop圖譜。生精細胞R-loop訊號在基因啟動子附近分佈較高，研究人員將前期NKAPL eCLIP-seq結合位點和R-loop圖譜進行聯合分析，NKAPL eCLIP訊號在生精細胞R-loop附近顯著富集。NKAPL敲除後的進一步研究表明，NKAPL缺失導致啟動子附近的平均R-loop訊號顯著減少，綜上結果提示NKAPL有助於R-loop的生物合成。綜上，減數分裂退出階段的轉錄延伸因子NKAPL與新生RNA結合，透過調控轉錄過程中的R-loop，促進paused Pol II的釋放，實現減數分裂退出轉換期單倍體基因的高效轉錄。
圖3.NKAPL特異調控RNA Pol II在啟動子近端停頓釋放的機理（引自原文Figure 6部分影象）
最後，為了探討NKAPL功能障礙在人類精子發生中的作用，研究人員在人類非梗阻性無精子症患者中鑑定出4例低頻、高效應的NKAPL基因突變位點，包括3例錯義突變和1例移碼突變，負荷檢驗表明這些突變與NOA風險增加顯著相關。基於人群發現，研究人員進一步構建了Nkapl移碼突變敲入小鼠，發現Nkapl突變雄鼠不育，呈現與NKAPL敲除鼠類似的減數分裂退出階段的發育缺陷，表明NKAPL蛋白第349位的功能缺失突變是男性不育潛在的遺傳致病因素。
南京醫科大學生殖醫學與子代健康全國重點實驗室葉嵐課題組博士康振龍、徐晨，胡志斌課題組博士後陸帥博士，葉嵐課題組碩士龔潔、閻若禹 （林明焰課題組聯合培養） 和羅幹為論文的主要貢獻作者，南京醫科大學生殖醫學與子代健康全國重點實驗室葉嵐教授和顧亞雲教授、美國貝勒醫學院孫正教授與南京醫科大學林明焰教授為本文共同通訊作者。
https://doi.org/10.1038/s41467-024-55579-y
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