近日，德國馬克斯·普朗克陸地微生物所博士和所在團隊設計出一條人工二氧化碳固定途徑，並將其命名為 THETA 迴圈。
圖 | 羅姍姍（來源：）
研究中，他們不僅在體外環境中構建和優化了這一迴圈，更是將其以模組化的方式引入大腸桿菌之中，標誌著在活細胞中構建高度正交的複雜人工固碳途徑邁出了第一步。
據瞭解，THETA 迴圈可被用於構建體外二氧化碳轉化平臺，從而將二氧化碳轉化為多種有用化學品比如生物燃料、生物材料以及高附加值化學品等。
同時，THETA 迴圈還有潛力將大腸桿菌轉化為自養型微生物，從而構建具有超自然固碳能力的細胞工廠。
日前，相關論文以《構建和模組化植入 THETA 迴圈以實現合成二氧化碳固定》（）為題發在 Nature Catalysis[1]。
是第一作者兼共同通訊，德國馬克斯·普朗克陸地微生物所託比亞斯·埃爾布（）擔任共同通訊作者。
圖 | 相關論文（來源：Nature Catalysis）
評審專家表示：“這項工作為合成生物學和二氧化碳固定相關的環境生物學領域做出了重大貢獻。”
Nature Catalysis 同期刊登的評論文章評價道：“本次成果為在活細胞中構建複雜的、正交的二氧化碳固定途徑提供了路線圖......有潛力將二氧化碳轉化為生物燃料、生物塑膠、藥品前體、以及特種化學品等高附加值化合物。”
（來源：Nature Catalysis）
二氧化碳研究之“未知數”
面對當前的氣候危機，開發高效的二氧化碳捕集技術、固定和封存技術已經成為當務之急。
在自然界中，植物、藻類和自養型微生物透過固碳途徑，利用光能或化學能將二氧化碳轉換為有機物。
儘管人類目前已經發現七條自然固碳途徑，但相比理論可行的所有固碳途徑，這僅僅是一小部分。
對於自然選擇來說，它更偏向於支援生長而非一味追求固碳效率。因此，許多在理論上具備更高效率的固碳途徑，並未出現在大自然之中。
合成生物學的發展，讓人們可以自由地組合各種酶、生化反應和反應機理，從而設計出能夠超越自然的人工二氧化碳固定途徑。然而，這條路上依然充滿挑戰，特別是在擁有複雜生化環境的細胞內實現這些途徑。
雖然已有研究透過表達少量基因，可以將自然二氧化碳固定途徑引入大腸桿菌等模型生物。
但是，對於含有眾多正交代謝產物和反應的人工二氧化碳固定途徑能否在體內實現？這依然是一個未知數。
（來源：Nature Catalysis）
人工固碳迴圈邁出體內實現第一步
因此，和同事將本次研究的目標定為：設計一條具有廣泛應用前景的高效人工固碳途徑。
固碳途徑的核心是固碳步驟，因此選擇效能優異的固碳酶尤為重要。研究中，他們選用兩種來自細菌的高效固碳酶。基於這些固碳酶，他們設計了反應途徑模組，進一步地將模組組裝成迴圈。
期間，該團隊也考慮了終產物、以及中間代謝物的效能。對於終產物來說，它應該具有轉化為多種有用化學品的潛力。而中間代謝物應該包含中心代謝產物，以便將迴圈植入細胞內。
基於此，他們設計了 THETA 迴圈。透過使用自然界中效能最優異的兩種固碳酶，讓 THETA 迴圈能夠將二氧化碳轉化為中心代謝產物——乙醯輔酶 A。並且在這種迴圈之中，還包含著多種中心代謝產物。
完成迴圈設計之後，課題組先是在體外環境中構建 THETA 迴圈，即在相對適宜的緩衝液環境中，利用純化之後的酶和輔酶來實現反應。
此外，透過新增校對反應、以及換用高活性酶這兩種方法，副反應和某些酶活性不足等瓶頸問題也被加以攻克。
隨後，其又利用機器學習、以及實驗室自動化操作，找到了更優的反應條件。整個最佳化過程將乙醯輔酶 A 的產量提高將近兩個數量級。
具體來說，他們在最佳化 THETA 迴圈的體外執行時，使用了機器學習的方法。體外 THETA 迴圈可被視為是一個包含 34 個變數的系統，這些變數包括酶濃度、緩衝液濃度、pH 值和輔酶濃度等。
研究中，課題組利用自研的機器學習模型 METIS，以產量為最佳化目標，每輪測試 30 個不同的反應條件。
在不同條件之下，34 個引數的取值也各不相同。於是他們採用自動化取樣裝置 Echo 設定不同的反應條件。
這時課題組將不同條件下的產量資料反饋給模型，這時模型就能學習引數與產量的關係，從而預測下一輪的 30 個測試條件。
經過九輪的迭代最佳化，他們找到一個較優的反應條件，其產量比最佳化前提高 4-5 倍。同時，利用 METIS 還可以分析各種引數變化對於產量的影響，從而瞭解上述系統的潛在瓶頸。
接著，他們開始將 THETA 迴圈引入細胞環境，並選擇大腸桿菌作為宿主。鑑於 THETA 迴圈的複雜性，他們將其拆分為三個模組，然後分別匯入大腸桿菌之中。
但是他們在體內構建模組三時遇到了最大的困難。儘管嘗試了多種方法，篩選菌株依舊無法利用該模組進行生長。
儘管基於生長選擇的方法是體內構建代謝途徑時廣泛使用的方法，但是這種方法無法揭示細胞內部的具體變化。
這時，代謝途徑的體內構建就像在“黑箱”中操作。於是，他們轉而嘗試開啟“黑箱”，看看細胞內引入新代謝途徑之後究竟發生了什麼？
後來，透過代謝組學分析的方法，他們瞭解到大腸桿菌中會發生兩步反應，從而消耗模組三的關鍵中間代謝產物。
這兩步反應雖然阻礙了模組的構建，但是他們意識到也能將其用於繞過模組中的限速步，從而將障礙轉化為優勢。
據此，他們調整了上述模組，在大腸桿菌中構建了“酸旁路”的模組三。由此可見，深入瞭解“黑箱”之內的情況，有利於構建細胞內的代謝途徑。而且，代謝途徑的可塑性非常高，透過合理的設計，有可能讓不利因素轉變為優勢。
利用生長選擇篩選和同位素標記的方法，他們證明這三個模組在細胞之內都能有效執行，這標誌著在細胞內構建高度正交且複雜的人工固碳迴圈邁出了第一步。
（來源：Nature Catalysis）
如何確保 100% 實現 THETA 迴圈？
那麼，在實驗條件下如何確保完全地實現 THETA 迴圈？
要想在體外環境中實現 THETA 迴圈，首先要擁有適當的酶，來催化迴圈中的反應。這些酶應該具有高活性、高穩定性和高度特異性。如果酶的效能不夠理想，可以透過酶工程或重新設計反應途徑等方法解決。
除此之外，還需要確定適宜的反應條件，比如緩衝液濃度、pH 值、輔酶濃度等，並確保輔酶的有效再生，從而驅動迴圈的執行。
而在體外迴圈建立之後，如何確保 THETA 迴圈在細菌體內也能成功執行？表示，為了確保 THETA 迴圈在細菌體內有效執行，必須保證迴圈中的各個反應能在細胞內順利進行。
同時，對於新引入的迴圈來說，它必須與細胞固有的代謝網路、代謝負荷和基因調控之間達到微妙的平衡。
此外，還必須為細胞提供充足的能量，從而驅動迴圈的執行。鑑於細胞內部複雜的生化環境，要想實現這些目標頗具挑戰。
這不僅需要合理的設計，還需大量的定向進化，利用細胞的突變和生長選擇，來達成人工固碳迴圈在細胞內的實現。
那麼在產量和效率上，體內迴圈和體外迴圈有差異嗎？答案是肯定的。
對於產量來說，它依賴於酶的濃度、以及具體的反應條件，而體內環境和體外環境有著顯著不同。
在體外環境下可更精確地控制酶濃度和反應條件，從而更容易對產量表現進行最佳化。
對於效率來說，無論是體外環境還是體內環境，都可以透過一定的最佳化，來讓 THETA 迴圈的實際效率接近理論效率。一般來說，透過抑制副反應、以及減少競爭代謝途徑等方法，將有助於提高迴圈的實際效率。
人工固碳迴圈和電催化二氧化碳還原有何不同？
你可能會好奇，本次所構建的人工固碳迴圈，和電催化二氧化碳還原有何異同？
事實上，人工固碳迴圈和電催化二氧化碳還原，都是在溫和反應條件之下，將二氧化碳轉化為有用化學品。因此，這兩種方法都是清潔綠色的二氧化碳轉化方式。
當進行人工固碳迴圈的時候，生物催化反應需要使用生物酶，因此催化的專一性很強，並且在催化 C-C 鍵形成上擁有一定優勢。
另外得益於生物反應的模組化特點，可以從生物構建分子出發合成多種生物大分子，因此在多碳化合物的生產選擇性和種類上，人工固碳迴圈有著一定的優越性，但還需要解決能量的持續供應問題。
電催化二氧化碳還原，在近些年發展得十分迅速。然而，目前大多數研究集中在將二氧化碳轉化為一碳化合物，仍然面臨著電催化過電勢高、多碳化合物產物選擇性低等問題。但是，在實現碳中和目標的路上，它們都是值得大力發展的關鍵技術。
“如能將這兩者加以有機結合，例如利用電能為人工生物固碳迴圈供能，透過生物催化將電還原產生的一碳化合物，進一步利用生物催化轉化為生物材料、生物燃料和高附加值化學品，就能最大化地利用各自的技術優勢，從而為實現碳中和貢獻更多力量。”表示。
而對於她和所在團隊來說，其遠期目標在於希望實現 THETA 迴圈在大腸桿菌中的執行，將其轉變為能讓二氧化碳作為唯一碳源的自養型微生物。
假如可以實現，就能建立一個既能固定二氧化碳、又能進行基因改造的細胞工廠。目前，他們正專注於最佳化 THETA 迴圈的模組，並計劃將三個模組整合到篩選菌株之中。
參考資料：
1.Luo，S.， Diehl， C.， He， H. et al. Construction and modular implementation of the THETA cycle for synthetic CO2 fixation. Nat Catal 6， 1228–1240 (2023). https://doi.org/10.1038/s41929-023-01079-z
運營/排版：何晨龍
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